目前最常用的分離方法是利用脂肪抽吸術，將得到的脂肪組織，用D-Hank′s液反復沖洗，剪碎。用預溫的0.1%I型膠原酶37℃，消化1h。100目篩網(wǎng)過濾除去未消化的組織。將濾出液置入離心管中，1000r/min，室溫離心10min，棄上清。用D-Hank′s液重懸洗滌，反復2-3次，以除去I型膠原酶，離心，棄去上清，并用移液管反復吹打，使之成為單細胞懸液，計數(shù)，以1~2×106/ml的接種密度接種于DMEM_LG+10%FBS培養(yǎng)液中，置37℃，5%CO2的飽和濕熱培養(yǎng)箱培養(yǎng)。接下來2天，每天換液一次，并用PBS輕輕洗滌，棄去組織塊和未貼壁的細胞，以后每3天換液一次。當細胞達80%-90%融合時，0.25%胰酶(含0.02%的EDTA)常規(guī)消化，進行傳代。
1g脂肪組織約可分離得到5000個CFU-F，利用脂肪抽吸術，每200ml脂肪組織可得到1×106個脂肪干細胞。它們對培養(yǎng)基中胎牛血清的來源和質量沒有嚴格要求，并且直至培養(yǎng)13-15代仍可保持穩(wěn)定的倍增率，其中衰老和死亡細胞所占的比例也很少。
脂肪干細胞在脂肪組織的血管周圍比較集中，同時可以分泌多種細胞因子，保持了其在結構與功能上的穩(wěn)定。利用組織塊消化及貼壁法從脂肪抽吸物中分離得到的脂肪干細胞，同時也混雜有其他的細胞，如血管平滑肌細胞、血管內皮細胞、血細胞、淋巴細胞、巨噬細胞和其他成纖維細胞等，然而經(jīng)過分離培養(yǎng)后，貼附在培養(yǎng)皿底部、形似成纖維細胞且經(jīng)多代培養(yǎng)不易衰老的細胞，即脂肪干細胞。脂肪干細胞的獲取量和分化能力不僅受供者年齡的影響，而且取材部位與手術方式的不同也有所區(qū)別。供體者的年齡是影響脂肪干細胞增生能力的一大因素，供者的年齡越小，細胞的增生能力越強，反之，則越差；來源于不同部位的脂肪干細胞凋亡傾向也不同，如腹部的脂肪干細胞不容易凋亡；利用脂肪抽吸術得到的脂肪干細胞不會影響其活性，只是吸管的粗細會影響脂肪顆粒的大小，進而影響分離的難易程度，但有超聲輔助的抽脂術獲取的脂肪干細胞增殖能力會有所降低。
脂肪組織在人體中大量存在，容易獲取，失去后對被采集者的影響較小，并且真空負壓抽脂術是目前整形外科一項成熟的技術，因此相對于其他干細胞，脂肪干細胞的獲取相對較易，從而也大大提升了其應用的潛力。
