肝臟是人體內(nèi)維持新陳代謝的主要器官。近年來(lái)，隨著人們生活水平的提高，肝臟疾病的發(fā)病率逐年增高，肝衰竭是肝臟疾病中最嚴(yán)重的表現(xiàn)。我國(guó)是世界人口大國(guó)，每年因各種原因?qū)е碌母嗡ソ呋颊叨噙_(dá)幾十萬(wàn)人，其高發(fā)生率、高死亡率及低治愈率嚴(yán)重影響人民生活質(zhì)量。骨髓
間充質(zhì)干細(xì)胞具有干細(xì)胞增殖和分化的潛能。近年來(lái)，對(duì)骨髓
間充質(zhì)干細(xì)胞的研究可能為肝衰竭的治療提供除肝移植以外更有效的方案。
1、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的生物學(xué)特性
干細(xì)胞是一類未分化的原始祖細(xì)胞，其最突出的特點(diǎn)是具有自我復(fù)制、增殖和分化的潛能，能在一定條件下分化為多種功能的細(xì)胞。干細(xì)胞根據(jù)其發(fā)育階段的不同，可分為胚胎干細(xì)胞和成體干細(xì)胞。成體干細(xì)胞根據(jù)其來(lái)源的不同，又可分為間充質(zhì)干細(xì)胞、造血干細(xì)胞和神經(jīng)干細(xì)胞。間充質(zhì)干細(xì)胞最初于上世紀(jì)60年代在骨髓中發(fā)現(xiàn)，故而將其命名為骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。由于其便于提取、來(lái)源廣泛，且具有干細(xì)胞自我更新、多向分化的潛能等優(yōu)點(diǎn)，現(xiàn)廣泛應(yīng)用于組織細(xì)胞移植、基因治療等領(lǐng)域。
骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞最突出的特點(diǎn)是其具有自我更新的能力，能夠增殖分裂為與其自身完全相同的細(xì)胞。其次它的多向分化潛能也極其強(qiáng)大。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞雖然是來(lái)源于中胚層的多能成體干細(xì)胞，但是其具有跨層和庫(kù)跨系分化的能力，能在一定條件下分化為中胚層的骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞，而且也可以分化為內(nèi)胚層的肌細(xì)胞、腸上皮細(xì)胞、肺細(xì)胞及為外胚層的上皮細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞等。
2、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)
骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離方法主要有4種：
（1）全骨髓貼壁培養(yǎng)法：根據(jù)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在低血清培養(yǎng)基中有貼壁生長(zhǎng)的優(yōu)勢(shì)特性，而造血干細(xì)胞有懸浮生長(zhǎng)的特性來(lái)對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞篩選，經(jīng)過(guò)數(shù)次換液傳代后除去不貼壁細(xì)胞，從而達(dá)到純化及擴(kuò)增骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的目的。
（2）密度梯度離心法：根據(jù)不同顆粒之間存在不同的密度、直徑等而導(dǎo)致它們?cè)谕蝗芤褐械某两邓俣炔煌谝欢x心力的作用下，顆粒被分配到密度梯度中某些特定位置上，從而形成不同區(qū)帶的原理來(lái)分離不同密度的細(xì)胞。在分離細(xì)胞前需要用一定的介質(zhì)在離心管內(nèi)形成連續(xù)或不連續(xù)的密度梯度，將細(xì)胞混懸液或勻漿置于介質(zhì)的頂部，通過(guò)重力或離心力的作用使細(xì)胞分層、分離，進(jìn)而得到所需細(xì)胞。
（3）流式細(xì)胞儀法：使用流式細(xì)胞儀通過(guò)對(duì)細(xì)胞形狀和大小進(jìn)行檢測(cè)來(lái)分選細(xì)胞。
（4）免疫磁珠法：其原理是基于細(xì)胞表面抗原能與連接在磁珠上的特異性單抗相結(jié)合，在外加磁場(chǎng)中，抗體與磁珠相連的細(xì)胞被吸附而留在磁場(chǎng)內(nèi)，無(wú)該種表面抗原的細(xì)胞則不能在磁場(chǎng)中停留，從而分離得到所需細(xì)胞。
目前常用的方法主要是全骨髓貼壁培養(yǎng)法和密度梯度離心法，后兩者免疫學(xué)方法雖然可獲取純度很高的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，但由于對(duì)細(xì)胞后續(xù)的增殖有影響，加之成本高、技術(shù)難度大等問(wèn)題，使其廣泛應(yīng)用受到了很大限制。密度梯度離心法可以獲得較高純度的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，但同時(shí)強(qiáng)大的離心力會(huì)對(duì)細(xì)胞造成損害，且可能增加污染機(jī)會(huì)。全骨髓貼壁培養(yǎng)法操作簡(jiǎn)便、耗時(shí)短，對(duì)細(xì)胞損傷小，分離得到的細(xì)胞分化潛能較好、增殖速度快，但其缺點(diǎn)是純度低，無(wú)法將和骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞一樣同樣具有粘附特性且同樣存在于骨髓中的其他細(xì)胞如成骨細(xì)胞等細(xì)胞篩出。
3、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞鑒定
骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的鑒定目前尚無(wú)特異性的分子標(biāo)志物，當(dāng)前公認(rèn)的鑒定方法是由國(guó)際細(xì)胞治療學(xué)會(huì)間充質(zhì)及組織干細(xì)胞委員會(huì)提出的三條最低標(biāo)準(zhǔn):
（1）符合貼壁生長(zhǎng)的生長(zhǎng)方式；
（2）表達(dá)CD29，CD90，CD105等間充質(zhì)干細(xì)胞的表面抗原，但不表達(dá)CD34，CD45，CD106等造血干細(xì)胞的表面抗原；
（3）有多向分化、自我更新復(fù)制的潛能。
只有當(dāng)所得細(xì)胞同時(shí)滿足以上三個(gè)條件時(shí)才可認(rèn)為它是骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。
4、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分化
骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞有向各胚層細(xì)胞分化的潛能這一特點(diǎn)已得到充分證實(shí)。研究表明骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在BMP-2的誘導(dǎo)下可分化為類心肌細(xì)胞，對(duì)急性心肌梗死再灌注損傷有治療作用，且相較于未經(jīng)BMP-2誘導(dǎo)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的治療效果理想。辛伐他汀可促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化，最適濃度為1.0μmol/ml，同時(shí)還不改變其免疫調(diào)節(jié)性能，因此，可用于治療骨科創(chuàng)傷和骨折不愈合的患者。
在對(duì)人類脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞、人類成人皮膚間充質(zhì)干細(xì)胞和人類新生皮膚間充質(zhì)干細(xì)胞及人類骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞這4種來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞比較后認(rèn)為：不同來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞在分化、分子表型及其生長(zhǎng)速率方面有著明顯差異，這可能是由于不同來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞中存在著各自不同影響其分化的“印記”。人類新生皮膚間充質(zhì)干細(xì)胞生長(zhǎng)速度最快，相對(duì)的人類脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞生長(zhǎng)速度最慢，這種差異雖不能反映不同來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞的特點(diǎn)，卻直接反映了供體年齡的差異。在分化方面，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞容易分化為成骨細(xì)胞，而脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞則更易分化為成脂肪細(xì)胞，皮膚間充質(zhì)干細(xì)胞比成骨細(xì)胞更易分化成脂肪細(xì)胞。4種來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞在分子表型方面的差異也使得其不能用于定義培養(yǎng)細(xì)胞的性質(zhì),而基于以上結(jié)論使得用其他來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)替代骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的方法變得不太可行。
用腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染，使其向神經(jīng)細(xì)胞分化。正常情況下，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分泌的腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子水平較低，很少分化為神經(jīng)細(xì)胞，但隨著腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子轉(zhuǎn)染時(shí)間的延長(zhǎng)，轉(zhuǎn)染的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖能力明顯增強(qiáng)，腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的分泌也隨之增多，同時(shí)，轉(zhuǎn)染后的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化成神經(jīng)樣細(xì)胞的比例也顯著高于原代骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，且分化的骨骼間充質(zhì)干細(xì)胞具有神經(jīng)元細(xì)胞的形態(tài)特征，表達(dá)神經(jīng)細(xì)胞特異性標(biāo)志物巢蛋白，神經(jīng)元特異性烯醇化酶和神經(jīng)膠質(zhì)纖維酸性蛋白。用肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子和成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子-4誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，使其成功分化為肝細(xì)胞樣細(xì)胞，這為今后體外移植干細(xì)胞提供了可能。
二、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的作用
1、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在其他系統(tǒng)作用
骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞由于其多向分化的潛能，在許多臨床領(lǐng)域都有廣泛應(yīng)用。
利用人類凍干的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞旁分泌因子和脫細(xì)胞后的松質(zhì)骨的三維骨支架組成了新型的具有生物活性的骨移植物，并用于下頜骨腫瘤切除術(shù)患者術(shù)后的移植治療，隨訪中并未發(fā)現(xiàn)有嚴(yán)重并發(fā)癥，進(jìn)而說(shuō)明了這種新型骨移植物可用于腫瘤切除術(shù)后有大面積缺損的下頜骨的移植治療。
利用患者自體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞植入聯(lián)合髓芯減壓支撐術(shù)治療股骨頭壞死，通過(guò)對(duì)治療組和對(duì)照組為期24個(gè)月的觀察訪問(wèn)發(fā)現(xiàn)，該法可加速股骨頭內(nèi)的修復(fù)，同時(shí)還可以明顯降低股骨頭壞死指數(shù)和塌陷的風(fēng)險(xiǎn)，有效延緩或避免了股骨頭的塌陷。而自體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨誘導(dǎo)又可以誘導(dǎo)壞死股骨頭新骨的形成，所有患者術(shù)后3個(gè)月均能下床活動(dòng)。同時(shí)對(duì)于早中期酒精性和激素性股骨頭壞死的治療也取得了顯著臨床效果，未發(fā)現(xiàn)嚴(yán)重并發(fā)癥和不良反應(yīng)，術(shù)后患者的AS疼痛評(píng)分、髖關(guān)節(jié)Harris評(píng)分、療效評(píng)價(jià)和壞死指數(shù)均明顯優(yōu)于術(shù)前。
運(yùn)用磁共振成像技術(shù)把SB623細(xì)胞植入到腦卒中患者體內(nèi)，SB623細(xì)胞是一種經(jīng)過(guò)修飾的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，是由將含有人類Notch-1通路的質(zhì)粒通過(guò)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染而產(chǎn)生的細(xì)胞，是一種治療由腦卒中導(dǎo)致的慢性運(yùn)動(dòng)障礙的細(xì)胞療法。在對(duì)其進(jìn)行為期24個(gè)月的訪問(wèn)后發(fā)現(xiàn)SB623細(xì)胞治療腦卒中的方法安全可行。期間雖有驚厥、短暫性腦缺血、敗血癥等嚴(yán)重并發(fā)癥，但其發(fā)生與細(xì)胞治療并無(wú)關(guān)系，在治療后1年左右發(fā)現(xiàn)臨床預(yù)后也有所改善。
骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞能分化為胰島素樣細(xì)胞，從而改善胰島功能。他們將高壓氧療法與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植相結(jié)合，在對(duì)
糖尿病患者進(jìn)行為期1年的隨訪后發(fā)現(xiàn)這些患者的機(jī)體代謝得到了很好控制，胰島功能也得到進(jìn)一步改善，同時(shí)還降低了對(duì)胰島素的需求。
急性心肌梗死患者移植骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞后可明顯改善其心功能，將69例進(jìn)行了經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入治療的患者隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，在PCI術(shù)后3周分別給予冠脈內(nèi)自體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞注射和生理鹽水注射，并在隨后的第3、6個(gè)月時(shí)用超聲和PET對(duì)患者進(jìn)行心功能評(píng)價(jià)，發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組患者梗死區(qū)域的運(yùn)動(dòng)速率和左室射血分?jǐn)?shù)均有顯著提高，且在6個(gè)月的隨訪中未發(fā)現(xiàn)死亡或嚴(yán)重并發(fā)癥的情況。
2、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在肝病中的作用
在對(duì)全世界10例3.5歲到16歲進(jìn)行了骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植的肝衰竭患兒的資料進(jìn)行分析后發(fā)現(xiàn)，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的移植對(duì)其肝衰竭的病情有很大幫助，其中有2名患兒完全恢復(fù)，4名患兒在神經(jīng)方面有可檢測(cè)到的改善，8名患兒氨水平和膽紅素水平在骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植48h后有所降低,同時(shí)未發(fā)現(xiàn)與手術(shù)有關(guān)的并發(fā)癥。
對(duì)527例乙肝肝衰竭患者進(jìn)行篩選后，選擇53例進(jìn)行骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植，并記為實(shí)驗(yàn)組，另選同期105例患者作為對(duì)照組，移植后2-3周，實(shí)驗(yàn)組患者肝功能改善明顯優(yōu)于對(duì)照組，其中白蛋白，總膽紅素、凝血酶原時(shí)間及終末期肝病評(píng)分均明顯高于對(duì)照組，然而，丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶水平?jīng)]有明顯改變，且這些方面的改善在移植36周后便沒(méi)有繼續(xù)維持下去。在192周的隨訪中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)嚴(yán)重副作用和并發(fā)癥(如出血、血腫、感染等)，也沒(méi)有觀察到肝細(xì)胞癌發(fā)病率的升高,這說(shuō)明自體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植對(duì)于乙型肝炎引起的肝功能衰竭患者是安全的,其短期療效良好（術(shù)后第1-36周），在肝衰竭的治療中起重要作用，同時(shí)能改善疾病狀況。而對(duì)于
肝硬化患者來(lái)言，自體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植也可能對(duì)HCC的發(fā)生和死亡率發(fā)揮更好的保護(hù)作用，雖然不能顯著改善這些患者的遠(yuǎn)期預(yù)后。
通過(guò)將骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞經(jīng)由門(mén)靜脈或外周靜脈輸注入不同病因所致的8名肝衰竭患者后，觀察到所有患者對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞均有很好的耐受性，MELD評(píng)分顯著降低，凝血酶原時(shí)間也有所減少，同時(shí)血肌酐、TBIL、ALB等肝功能指標(biāo)也有明顯好轉(zhuǎn)。
三、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞治療肝衰竭
將84名肝功能失代償期患者隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組采用常規(guī)治療加肝左右動(dòng)脈骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療，對(duì)照組采用常規(guī)對(duì)癥治療的同時(shí)加用恩替卡韋、扶正化瘀膠囊，隨后2年的訪問(wèn)中發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)組在肝纖維化、肝功能和MELD評(píng)分三方面均優(yōu)于對(duì)照組，且實(shí)驗(yàn)組治療后24周MELD評(píng)分低于治療后12周,1年生存率也高于對(duì)照組。自體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植能顯著改善肝衰竭患者肝纖維化狀態(tài)和肝功能，降低患者M(jìn)ELD評(píng)分，提高患者1年生存率，同時(shí)無(wú)相關(guān)不良反應(yīng)的發(fā)生。
靜脈注射的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在受損的肝臟中種植，使肝臟炎癥反應(yīng)減輕，淋巴細(xì)胞增殖減少，顯著減少肝臟和整個(gè)機(jī)體內(nèi)激活的NKT細(xì)胞的數(shù)量，提示骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞介導(dǎo)的淋巴細(xì)胞抑制是系統(tǒng)性的，而不是僅僅局限于肝臟。同時(shí)還顯著降低了血清和肝臟中主要促炎因子的水平,而對(duì)IL-4、IL-10的表達(dá)沒(méi)有影響。異體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植對(duì)肝衰竭的治療安全有效。將110名患者隨機(jī)分為對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組，分別給予單獨(dú)內(nèi)科治療和內(nèi)科治療加骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞輸注雙重治療，在為期24個(gè)月的隨訪中發(fā)現(xiàn),實(shí)驗(yàn)組生存率明顯高于對(duì)照組，TBIL及MELD評(píng)分也有顯著改善，嚴(yán)重感染及多器官功能衰竭病死率也較對(duì)照組低,但實(shí)驗(yàn)組在接受治療5-24周時(shí)發(fā)熱發(fā)生率較對(duì)照組高，考慮可能與異體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞輸注有關(guān)。隨訪中未發(fā)現(xiàn)腫瘤的發(fā)生。
四、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞治療肝衰竭存在的問(wèn)題
隨著對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞研究的深入，其已在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域乃至整個(gè)生命科學(xué)領(lǐng)域有了廣闊的應(yīng)用前景，但其中仍存在許多問(wèn)題有待解決：
（1）骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的提取方法眾多，但沒(méi)有統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)來(lái)獲得純度高、分化潛能較好、增殖速度快的干細(xì)胞；
（2）干細(xì)胞的鑒定仍沒(méi)有統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，目前只能從細(xì)胞形態(tài)、表面抗原表型和功能特性來(lái)綜合鑒定；
（3）對(duì)于干細(xì)胞療法的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床實(shí)驗(yàn)很多，但具體輸注方法、治療時(shí)機(jī)、輸注細(xì)胞數(shù)量等仍存在爭(zhēng)議；
（4）細(xì)胞移植后怎樣進(jìn)行示蹤也困擾著臨床醫(yī)生，目前只能通過(guò)機(jī)體功能檢測(cè)來(lái)評(píng)價(jià)療效；
（5）移植后干細(xì)胞是如何發(fā)揮其作用機(jī)制的問(wèn)題也不十分明確。
干細(xì)胞對(duì)于肝衰竭的治療雖然存在多個(gè)問(wèn)題尚未明了，但相信隨著對(duì)干細(xì)胞更加深入的研究，這些問(wèn)題都能逐一解決，并為其他疾病的治療提供更多幫助。
